3PGDH CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401405-ACT

Humanes PHGDH kodiert die 3‑Phosphoglycerat‑Dehydrogenase (3PGDH), das erste und geschwindigkeitsbestimmende Enzym des de‑novo‑Serinbiosynthesewegs, der das glykolytische Intermediat 3‑Phosphoglycerat in Richtung L‑Serin und des nachgeschalteten Ein‑Kohlenstoff‑Stoffwechsels umleitet. Über die Kontrolle der Serin‑ und Glycinpools beeinflusst PHGDH die Nukleotidsynthese, Methylierungsreaktionen und das zelluläre Redoxgleichgewicht über NADH/NADPH‑gekoppelte Stoffwechselprozesse. Eine Fehlregulation von PHGDH wird mit metabolischer Reprogrammierung in proliferativen Zuständen sowie mit neurometabolischen Phänotypen in Verbindung gebracht, bei denen die Serinverfügbarkeit protein‑, lipid‑ und neurotransmitterbezogene Biosyntheseprozesse begrenzt. Als Knotenpunkt, der die Glykolyse mit dem Fluss durch Aminosäure‑ und Folatzyklus verknüpft, wird 3PGDH häufig in Studien zu Nährstoffabhängigkeit, mitochondrisch‑zytosolischem metabolischem Crosstalk und Stressadaptation untersucht.

3PGDH Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PHGDH-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

3PGDH Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PHGDH-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PHGDH-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen 3PGDH-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PHGDH-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von 3PGDH-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des 3PGDH-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PHGDH-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.