Plásmido CRISPR de Activación (h) 14-3-3 η: sc-402892-ACT

YWHAH codifica la proteína adaptadora humana 14-3-3 eta (η), un miembro de la familia 14-3-3 que se une a motivos de fosfoserina/fosfotreonina para modular la localización y estabilidad de las proteínas, así como el ensamblaje de complejos de señalización. Mediante interacciones con diversas quinasas, fosfatasas y reguladores transcripcionales, 14-3-3η participa en el control dependiente de la fosforilación de la progresión del ciclo celular, las respuestas al estrés y la apoptosis, intersectando vías como MAPK/ERK, PI3K–AKT y la señalización de RAF. La actividad alterada de YWHAH se ha investigado en contextos de proliferación y supervivencia desreguladas, incluidos fenotipos relacionados con la neurobiología y la reprogramación de la señalización asociada al cáncer. Como andamiaje que integra múltiples entradas de señalización, 14-3-3η se estudia con frecuencia por su impacto en la proteostasis, la dinámica del citoesqueleto y programas transcripcionales dependientes del contexto.

14-3-3 η El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de YWHAH sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

14-3-3 η El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus YWHAH en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional YWHAH, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de 14-3-3 η. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo YWHAH y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de 14-3-3 η en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía 14-3-3 η en células tumorales con expresión de YWHAH silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.