Plásmido CRISPR de Activación (h) 14-3-3 ε: sc-400998-ACT

YWHAE codifica la proteína adaptadora humana 14-3-3 épsilon (ε), un regulador que se une a fosfoserina/fosfotreonina y modula la localización, estabilidad y actividad de diversas proteínas diana. Mediante interacciones con quinasas e intermediarios de señalización, 14-3-3 ε ayuda a coordinar las vías PI3K/AKT, MAPK y los puntos de control del ciclo celular, influyendo en la apoptosis, la proliferación y las respuestas al estrés. Contribuye a la remodelación del citoesqueleto y a vías del desarrollo neuronal al actuar como andamiaje de complejos de fosfoproteínas y ajustar el tráfico subcelular. La expresión desregulada de YWHAE o las interacciones alteradas de 14-3-3 ε se han asociado con fenotipos del neurodesarrollo y redes de señalización oncogénicas, lo que respalda su uso en estudios mecanísticos de reconfiguración de la señalización.

14-3-3 ε El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de YWHAE sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

14-3-3 ε El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus YWHAE en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional YWHAE, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de 14-3-3 ε. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo YWHAE y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de 14-3-3 ε en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía 14-3-3 ε en células tumorales con expresión de YWHAE silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.