Plásmido CRISPR de Activación (h) γC-crystallin: sc-402940-ACT

CRYGC codifica la γC-cristalina humana, una proteína estructural muy abundante del cristalino ocular que contribuye al índice de refracción y a la transparencia a largo plazo mediante ensamblajes proteicos estables y estrechamente empaquetados. Como miembro de la superfamilia de β/γ-cristalinas, la γC-cristalina sostiene la arquitectura de las células de las fibras del cristalino y la proteostasis en condiciones de recambio proteico mínimo. La alteración de la homeostasis de las cristalinas puede favorecer el mal plegamiento y la agregación de proteínas, lo que vincula la desregulación de CRYGC con fenotipos de opacidad del cristalino. Por ello, CRYGC se utiliza ampliamente como marcador y como punto de entrada mecanístico para estudiar el desarrollo del cristalino, las respuestas al estrés y los procesos de agregación proteica relevantes para la biología de la catarata.

γC-crystallin El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CRYGC sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

γC-crystallin El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CRYGC en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CRYGC, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de γC-crystallin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CRYGC y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de γC-crystallin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía γC-crystallin en células tumorales con expresión de CRYGC silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.