Plasmide CRISPR d'Activation (h) β-1,4-GalNAc-T4: sc-410420-ACT

B4GALNT4 code la β-1,4-GalNAc-T4, une glycosyltransférase résidente de l’appareil de Golgi qui transfère la N-acétylgalactosamine sur des accepteurs glycoconjugués, façonnant ainsi les structures glycanes terminales des glycoprotéines et des glycolipides. Par son rôle dans la biosynthèse et le remodelage des glycannes, la β-1,4-GalNAc-T4 peut influencer le trafic des protéines, l’organisation des récepteurs et les processus de reconnaissance cellule–cellule qui dépendent des profils de glycosylation à la surface cellulaire. Les modifications d’expression ou d’activité des GalNAc-transférases sont fréquemment étudiées dans le contexte d’une glycosylation dérégulée, une caractéristique associée à des changements d’adhésion, de signalisation et d’interactions immunitaires dans la biologie des maladies. Par conséquent, B4GALNT4 est pertinent pour la recherche sur les voies dépendantes de la glycosylation et la modulation des phénotypes dans des modèles cellulaires humains.

β-1,4-GalNAc-T4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de B4GALNT4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

β-1,4-GalNAc-T4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus B4GALNT4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription B4GALNT4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de β-1,4-GalNAc-T4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus B4GALNT4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de β-1,4-GalNAc-T4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie β-1,4-GalNAc-T4 dans les cellules tumorales présentant une expression de B4GALNT4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.