Plasmide CRISPR d'Activation (h) α-actinin-2: sc-401186-ACT

ACTN2 code l’α-actinine-2, une protéine de liaison et de pontage de l’actine sensible au Ca2+ qui se localise aux disques Z du muscle strié et contribue à l’architecture du sarcomère, à la transmission de la force et au remodelage mécanosensible. En ancrant les filaments d’actine et en coordonnant des assemblages multiprotéiques au niveau de l’appareil contractile, l’α-actinine-2 s’inscrit à l’interface entre la dynamique du cytosquelette et des réseaux de signalisation qui couplent adhésion, tension et réponses transcriptionnelles. Des variants ou une dérégulation d’ACTN2 ont été associés à des phénotypes de cardiomyopathie et à un risque lié aux arythmies, ce qui en fait une cible pertinente pour étudier les perturbations associées aux maladies touchant l’organisation des myofibrilles et la fonction du muscle cardiaque.

α-actinin-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ACTN2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

α-actinin-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ACTN2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ACTN2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de α-actinin-2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ACTN2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de α-actinin-2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie α-actinin-2 dans les cellules tumorales présentant une expression de ACTN2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.