ZNRF1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-431297-ACT

Das murine Gen **Znrf1** kodiert **ZNRF1**, eine RING-Typ-E3-Ubiquitin-Ligase, die den Proteinumsatz über ubiquitinabhängige Signalwege mitreguliert und so zur neuronalen Homöostase sowie zu zellulären Stressantworten beiträgt. Die Aktivität von ZNRF1 wurde mit der Aufrechterhaltung von Axonen und mit Degenerationsprogrammen in Verbindung gebracht, unter anderem durch die Beeinflussung der Stabilität wichtiger Substrate in verletzungs- und stressassoziierten Signalwegen. Über die Kontrolle der Ubiquitinierung kann ZNRF1 die Proteostase, die Zytoskelettdynamik und Überlebenssignale beeinflussen, die für die Neurobiologie zentral sind. Eine Fehlregulation dieser Prozesse ist relevant für Modelle der Neurodegeneration und peripherer Nervenverletzung, bei denen veränderte Ubiquitin-Signalgebung und axonale Integrität zu krankheitsassoziierten Phänotypen beitragen.

ZNRF1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Znrf1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ZNRF1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Znrf1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Znrf1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ZNRF1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Znrf1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ZNRF1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ZNRF1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Znrf1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.