ZNF649 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-418512-ACT

ZNF649 codifica un fattore di trascrizione a dita di zinco di tipo C2H2, implicato nel legame al DNA in modo sequenza-specifico e nella regolazione di programmi di espressione genica che influenzano l’identità cellulare e i processi associati alla cromatina. In quanto proteina regolatoria nucleare, ZNF649 viene spesso considerato nell’ambito di reti più ampie legate alle dita di zinco KRAB, che modulano le dinamiche di repressione/attivazione trascrizionale, potenzialmente influenzando la progressione del ciclo cellulare, la differenziazione e le vie di risposta allo stress. Un’alterata regolazione dei fattori di trascrizione a dita di zinco è stata associata a circuiti trascrizionali deregolati nel cancro e in altre patologie caratterizzate da un controllo epigenetico aberrante, rendendo ZNF649 rilevante per studi meccanicistici dell’omeostasi trascrizionale. Indagare l’attività di ZNF649 può contribuire a chiarire come eventi di legame associati a promotori ed enhancer plasmino la segnalazione a valle e le reti di regolazione genica nelle cellule umane.

ZNF649 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ZNF649 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ZNF649 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ZNF649 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ZNF649, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ZNF649. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ZNF649 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ZNF649 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ZNF649 nelle cellule tumorali con espressione di ZNF649 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.