ZIP4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-412558-ACT

SLC39A4 kodiert den menschlichen Zinktransporter ZIP4, ein multipassiges Membranprotein, das die zelluläre Aufnahme von extrazellulärem Zn2+ vermittelt und zur Aufrechterhaltung einer zinkabhängigen metabolischen und signalvermittelten Homöostase beiträgt. Die ZIP4-Aktivität unterstützt unter anderem Prozesse wie epitheliale Differenzierung, Barriereintegrität und metallresponsive Transkriptionsprogramme, mit nachgeschalteten Effekten auf Antworten auf oxidativen Stress sowie auf Proteinsynthesewege, die Zink als strukturellen oder katalytischen Kofaktor benötigen. Eine dysregulierte Expression oder Funktion von SLC39A4 stört die Zinkverfügbarkeit und wurde mit Störungen der Zinkabsorption sowie breiteren Phänotypen in Verbindung gebracht, die Wachstum, Immunfunktion und die Aufrechterhaltung epithelialer Gewebe betreffen. Da Zink zahlreiche Enzyme und Transkriptionsfaktoren beeinflusst, wird ZIP4 häufig als upstream Regulator von Nährstoffsensorik- und Stressadaptationsnetzwerken untersucht.

ZIP4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLC39A4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ZIP4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLC39A4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLC39A4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ZIP4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLC39A4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ZIP4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ZIP4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLC39A4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.