Zimp10 Plasmídeo CRISPR/Cas9 KO (h): sc-407608

Visão geral

ZMIZ1 codifica Zimp10, um co-regulador transcricional semelhante às PIAS que modula a expressão gênica ao atuar em parceria com fatores de transcrição específicos de sequência e com componentes da maquinaria de SUMOilação. Zimp10 tem sido associado à regulação da sinalização de receptores nucleares, a programas transcricionais associados à cromatina e a decisões de destino celular, incluindo efeitos sobre proliferação e diferenciação. Por meio dessas funções, ZMIZ1 é frequentemente estudado em vias relevantes para o desenvolvimento hematopoiético e a regulação imunológica, nas quais o controle transcricional alterado pode contribuir para estados de expressão gênica associados a doenças. A atividade desregulada de ZMIZ1 e a variação genética têm sido investigadas no contexto da biologia do câncer e de distúrbios mediados pelo sistema imune, o que sustenta sua utilidade como um nó para estudos mecanísticos de redes transcricionais.

O Zimp10 CRISPR/Cas9 KO Plasmid (h) é um conjunto de plasmídeos concebido para a interrupção direcionada do gene ZMIZ1 em human linhas celulares. Cada plasmídeo do conjunto coexpressa um sgRNA único, direcionado a um local distinto dentro do locus ZMIZ1, juntamente com a nuclease Cas9 de Streptococcus pyogenes, e codifica GFP para permitir a identificação fluorescente e o enriquecimento das células transfectadas com sucesso. Esta estratégia multiguia aumenta a probabilidade de induzir deslocamentos de quadro de leitura ou deleções que produzam um knockout funcional, oferecendo uma alternativa mais robusta às abordagens de guia único. As DSBs induzidas em múltiplos locais são resolvidas através da junção de extremidades não homólogas (NHEJ) ou, quando utilizadas com o modelo doador HDR incluído, através da reparação dirigida por homologia (HDR) num local-alvo definido dentro do locus.

Quando utilizado em conjunto com o doador HDR que expressa RFP, a fluorescência de GFP e RFP pode ser utilizada em conjunto para distinguir populações de células transfectadas das editadas, simplificando os fluxos de trabalho de triagem e seleção de clones baseados em citometria de fluxo.

Doador de Reparação Dirigida por Homologia (HDR) — Cassete de Puromicina com Repórter RFP

Para aplicações que requerem clones knockout confirmados e selecionáveis, o Zimp10 Plasmídeo HDR (h) inclui uma construção doadora HDR contendo uma cassete de resistência à puromicina (PuroR) e um repórter de proteína fluorescente vermelha (RFP), flanqueados por braços de homologia específicos para um local-alvo definido ZMIZ1.
Quando co-transfectado com o Zimp10 Plasmídeo CRISPR/Cas9 KO (h):

• A cassete PuroR-RFP integra-se no local de corte da Cas9 através de HDR, interrompendo o quadro de leitura aberto ZMIZ1.
  A fluorescência da RFP fornece um indicador visual imediato do sucesso da integração, permitindo a identificação ou triagem baseada na fluorescência das células editadas antes ou em paralelo com a seleção por puromicina.
  As células editadas com sucesso são confirmadas através da resistência à puromicina, reduzindo substancialmente a carga de triagem de clones.
  Esta estratégia de seleção é ideal para gerar linhas celulares KO clonais estáveis para estudos funcionais a jusante, triagem de fármacos ou desenvolvimento de modelos.

Sistema de remoção de cassete Cre-lox

A construção doadora HDR apresenta sítios loxP flanqueando a cassete de seleção PuroR-RFP para permitir a remoção limpa do marcador após a confirmação do clone. A expressão transitória da recombinase Cre através do Vetor Cre: sc-418923 incluído excisa a cassete, deixando um local loxP residual mínimo dentro do locus ZMIZ1 e eliminando potenciais efeitos de confusão em ensaios a jusante.
Esta abordagem em duas etapas:

• Minimiza a perturbação da arquitetura local da cromatina e dos elementos reguladores vizinhos
  Restaura um contexto genómico quase nativo no locus editado
  Permite a reutilização da estratégia de seleção com puromicina na mesma linha celular para edições adicionais

Características principais

• gRNA direcionado para o(s) exão(ões) ZMIZ1 crítico(s) para a função Zimp10
  Coexpressão de SpCas9 e sgRNA a partir de um único plasmídeo para uma entrega simplificada
  Doador HDR com resistência à puromicina para seleção positiva de clones
  Cassete PuroR flanqueada por loxP com vetor de recombinase Cre para remoção contínua do marcador
  Fornecido pronto a usar para entrega por transfecção

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.