Plasmide CRISPR d'Activation (m) ZC3H13: sc-426493-ACT

Zc3h13 code pour ZC3H13, une protéine de liaison à l’ARN à doigt de zinc de type CCCH qui constitue un composant central de la machinerie associée au « writer » de la N6‑méthyladénosine (m6A) des ARNm. Dans les cellules de souris, ZC3H13 favorise la localisation nucléaire et le rôle d’échafaudage des complexes régulateurs de la m6A, influençant le traitement co‑transcriptionnel de l’ARN, l’épissage alternatif, la stabilité des ARNm et des programmes d’expression génique liés aux décisions de destinée cellulaire. Par ces fonctions, ZC3H13 s’inscrit à l’interface de voies contrôlant la régulation transcriptionnelle et le contrôle post‑transcriptionnel qui façonnent le développement et l’homéostasie tissulaire. La dérégulation des composants de la voie m6A, y compris des réseaux associés à ZC3H13, a été impliquée dans des états de différenciation altérés et des signatures transcriptionnelles pertinentes pour la maladie, faisant de Zc3h13 une cible utile pour des études mécanistiques.

ZC3H13 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Zc3h13 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ZC3H13 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Zc3h13 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Zc3h13, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ZC3H13. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Zc3h13 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ZC3H13 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ZC3H13 dans les cellules tumorales présentant une expression de Zc3h13 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.