Plasmide CRISPR d'Activation (h) XPF: sc-401692-ACT

ERCC4 code l’endonucléase humaine spécifique de structure XPF, qui forme un hétérodimère avec ERCC1 afin d’effectuer l’incision 5′ lors de la réparation par excision de nucléotides (NER) et de traiter les pontages interbrins de l’ADN via le réseau Fanconi anemia/HR. XPF reconnaît des structures d’ADN ramifiées et contribue à la résolution des fourches de réplication bloquées, maintenant la stabilité du génome en situation de stress endogène ou génotoxique. La perturbation de la fonction d’ERCC4/XPF est associée à des syndromes de déficience de réparation de l’ADN, notamment le xeroderma pigmentosum et des phénotypes progéroïdes apparentés, et elle est pertinente pour les études de la cancérogenèse en raison d’une élimination altérée des lésions et d’une charge mutationnelle accrue. Par conséquent, ERCC4 est fréquemment étudié dans des modèles de réponse aux dommages induits par les UV, de réparation des pontages, de stress réplicatif et de signalisation des points de contrôle.

XPF Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ERCC4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

XPF Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ERCC4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ERCC4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de XPF. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ERCC4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de XPF au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie XPF dans les cellules tumorales présentant une expression de ERCC4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.