WT1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400095-ACT

WT1 (Wilms-Tumor 1) kodiert einen Zinkfinger-Transkriptionsfaktor, der während der embryonalen Entwicklung und der Gewebehomöostase Zellschicksalsentscheidungen reguliert, mit wichtigen Funktionen in der Nephrogenese, der Gonadenentwicklung und der mesothelialen Differenzierung. WT1 moduliert Transkriptionsprogramme, die Proliferation, Apoptose, epithelial–mesenchymale Übergänge und Linienfestlegung steuern, und steht in Wechselwirkung mit Signalwegen wie Wnt/β-Catenin, der TGF-β-Signalübertragung und wachstumsfaktorresponsiven Netzwerken. In der menschlichen Biologie werden veränderte WT1-Expression oder Mutationen mit Entwicklungsstörungen sowie unterschiedlichen Krebs-Kontexten in Verbindung gebracht, in denen WT1 kontextabhängig als transkriptioneller Regulator onkogener oder tumorsuppressiver Gensätze wirken kann. Diese Eigenschaften machen WT1 zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung der Umverdrahtung transkriptioneller Netzwerke, von Differenzierungstrajektorien und stressresponsiver Genregulation.

WT1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen WT1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

WT1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des WT1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der WT1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen WT1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native WT1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von WT1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des WT1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem WT1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.