Wnt-5a CRISPR Activation Plasmid (m): sc-423718-ACT

Wnt5a kodiert Wnt-5a, ein sezerniertes Glykoprotein, das überwiegend über nicht-kanonische Wnt-Signalwege signalisiert und so Zellpolarität, Migration und Gewebemorphogenese reguliert. Wnt-5a bindet an Rezeptoren wie ROR1/2 und Frizzled und aktiviert Signalwege der planaren Zellpolarität sowie Ca²⁺-abhängige Signalkaskaden, wodurch Zytoskelettdynamik und gerichtete Zellbewegung beeinflusst werden. In der Maus ist Wnt5a für die embryonale Musterbildung, die Gliedmaßenentwicklung und die Organogenese essenziell; eine Fehlregulation wird häufig im Zusammenhang mit Entzündung, Fibrose und Signalprozessen in der Tumormikroumgebung untersucht. Eine veränderte Wnt-5a-Aktivität kann zudem das Crosstalk mit der β‑Catenin-Signalgebung modulieren und dadurch Differenzierung sowie das Verhalten von Stamm-/Vorläuferzellen in entwicklungs- und krankheitsrelevanten Modellen prägen.

Wnt-5a Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Wnt5a-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Wnt-5a Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Wnt5a-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Wnt5a-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Wnt-5a-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Wnt5a-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Wnt-5a-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Wnt-5a-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Wnt5a-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.