Wnt-2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402665-ACT

Das humane Gen WNT2 kodiert Wnt-2, einen sezernierten Glykoprotein-Liganden, der die Wnt-Signalgebung aktiviert und so die embryonale Entwicklung, die Gewebemusterbildung sowie die stromal–epitheliale Kommunikation im adulten Gewebe reguliert. Wnt-2 bindet vorwiegend an Frizzled-Rezeptoren und die Korezeptoren LRP5/6, fördert dadurch die Stabilisierung von β-Catenin und aktiviert Transkriptionsprogramme, die Proliferation, Differenzierung und Zellschicksalsentscheidungen steuern. Darüber hinaus ist es in nicht-kanonische Wnt-Signalwege eingebunden, die kontextabhängig die Zytoskelettdynamik und Zellmigration beeinflussen. Eine fehlregulierte WNT2-Expression und veränderte Signalwegaktivität wurden mit gestörter Morphogenese sowie mit Veränderungen der mikroenvironmentalen Signalgebung in Zusammenhang gebracht, die für onkogene Prozesse und fibrotisches Remodelling relevant sind, was seine Untersuchung als Signalwegknoten in krankheitsrelevanten Modellen unterstützt.

Wnt-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen WNT2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Wnt-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des WNT2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der WNT2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Wnt-2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native WNT2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Wnt-2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Wnt-2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem WNT2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.