Wig-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-406638-ACT

ZMAT3 (Wig-1) ist ein p53-induzierbares Zinkfinger‑RNA‑Bindungsprotein, das die posttranskriptionelle Genexpression reguliert, indem es an AU-reiche Elemente bindet und die Stabilität bzw. Translation ausgewählter mRNAs stabilisiert oder moduliert. Über die Kontrolle des RNA-Umsatzes und stressresponsiver Transkripte beeinflusst Wig-1 den Zellzyklusverlauf, die Apoptose und RNA-Überwachungsprogramme, die zelluläre Antworten auf DNA-Schäden und onkogenen Stress prägen. Eine Fehlregulation der ZMAT3-Aktivität wurde mit einer veränderten Output-Signatur des p53-Netzwerks und mit Veränderungen in tumorassoziierten Genexpressionssignaturen in Verbindung gebracht, was ZMAT3 für mechanistische Studien in der Krebsbiologie und Stresssignalgebung relevant macht. Seine RNA-bindenden Funktionen eignen sich zudem zur Untersuchung von mRNA-Stabilitätswegen und der kontextabhängigen Regulation pro- und antiapoptotischer Transkripte.

Wig-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ZMAT3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Wig-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ZMAT3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ZMAT3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Wig-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ZMAT3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Wig-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Wig-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ZMAT3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.