WASP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400712-ACT

Das menschliche WAS-Gen kodiert das Wiskott-Aldrich-Syndrom-Protein (WASP), einen auf hämatopoetische Zellen beschränkten Regulator des Umbaus des Aktinzytoskeletts, der rezeptorproximale Signalgebung mit der Arp2/3-abhängigen Aktin-Nukleation verknüpft. Über Interaktionen mit Cdc42, Phosphoinositiden und SH3-Domänen-Adaptern koordiniert WASP die Bildung der immunologischen Synapse, Chemotaxis, Phagozytose und vesikulären Transport und prägt damit die Aktivierung von T- und B-Zellen ebenso wie Effektorfunktionen der angeborenen Immunität. Die WASP-Aktivität integriert Signale von Immunrezeptoren und Integrinen, um die Zytoskelettdynamik und transkriptionelle Outputs während Immunantworten zu steuern. Eine gestörte WAS-Funktion ist mit Immundefizienz und dysregulierter Entzündung assoziiert, wodurch WAS/WASP ein zentrales Ziel für mechanistische Studien zur zytoskelettgetriebenen Signalübertragung in menschlichen Immunzellen darstellt.

WASP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen WAS-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

WASP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des WAS-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der WAS-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen WASP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native WAS-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von WASP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des WASP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem WAS-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.