Plásmido CRISPR de Activación (h) VPS35: sc-402019-ACT

VPS35 codifica una subunidad central del complejo retromer, que regula la recuperación desde endosomas hacia la red trans del Golgi y el reciclaje endosomal de diversas proteínas de carga, manteniendo así la homeostasis de las proteínas de membrana y la integridad de los orgánulos. Mediante interacciones con las nexinas de clasificación (sorting nexins) y el complejo WASH, VPS35 ayuda a coordinar la tubulación endosomal, la dinámica de la actina y las rutas de tráfico que influyen en la señalización de receptores, la función lisosomal y la autofagia. La alteración de la clasificación dependiente de VPS35 puede afectar el control de calidad mitocondrial y la proteostasis, vinculando la disfunción del retromer con la neurodegeneración y otros trastornos asociados a un tráfico endolisosomal defectuoso. Como nodo central en las vías de transporte intracelular, VPS35 se utiliza ampliamente para investigar mecanismos de clasificación de cargas, mantenimiento sináptico y respuestas al estrés en modelos celulares humanos.

VPS35 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de VPS35 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

VPS35 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus VPS35 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional VPS35, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de VPS35. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo VPS35 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de VPS35 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía VPS35 en células tumorales con expresión de VPS35 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.