VPS13A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-407168-ACT

VPS13A kodiert das vakuoläre Protein-Sortierungs-assoziierte Protein 13A, einen großen Lipidtransferfaktor, der an Membrankontaktstellen lokalisiert ist und die Lipidhomöostase, die Organellendynamik und den vesikulären Transport unterstützt. VPS13A ist an der Kommunikation zwischen Mitochondrien und endoplasmatischem Retikulum beteiligt, an autophagieassoziierten Prozessen sowie an der Aufrechterhaltung der Membranintegrität von Neuronen und Erythrozyten durch die Regulation der Phospholipidverteilung. Eine Störung der VPS13A-Funktion ist mit neurodegenerativen Phänotypen und der Biologie von Bewegungsstörungen verknüpft, einschließlich der Pathogenese der Chorea-Akanthozytose, und wird zunehmend auch im Kontext zellulärer Stressantworten und Membranumbauprozesse untersucht. Dadurch bietet VPS13A einen mechanistischen Ansatzpunkt, um Signalwege zu untersuchen, die intrazellulären Transport mit mitochondrialer Funktion und Neurobiologie koppeln.

VPS13A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen VPS13A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

VPS13A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des VPS13A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der VPS13A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen VPS13A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native VPS13A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von VPS13A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des VPS13A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem VPS13A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.