VGLUT2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403888-ACT

SLC17A6 kodiert den vesikulären Glutamattransporter 2 (VGLUT2), ein Membranprotein synaptischer Vesikel, das Glutamat in präsynaptische Vesikel lädt und so die exzitatorische Neurotransmission unterstützt. Durch die Kontrolle des vesikulären Glutamatgehalts und der quantalen Freisetzung trägt VGLUT2 dazu bei, synaptische Stärke, die Entwicklung neuronaler Schaltkreise und aktivitätsabhängige Plastizität in zentralen und peripheren Neuronen zu formen. Die Funktion von VGLUT2 steht im Zusammenhang mit Vesikeltransport, den durch die V-ATPase aufgebauten elektrochemischen Protonengradienten sowie glutamatergen Signalwegen, die neuronale Erregbarkeit und die Synchronisation von Netzwerken steuern. Eine veränderte Glutamat-Handhabung und das Gleichgewicht zwischen exzitatorischer und inhibitorischer Aktivität bringen von SLC17A6 regulierte Prozesse mit neuroentwicklungsbezogenen und neuropsychiatrischen Phänotypen in Verbindung, ebenso wie mit Mechanismen, die für exzitotoxischen Stress relevant sind.

VGLUT2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLC17A6-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

VGLUT2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLC17A6-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLC17A6-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen VGLUT2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLC17A6-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von VGLUT2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des VGLUT2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLC17A6-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.