Plasmide Double Nickase (h) VAP-A: sc-403093-NIC

VAPA code VAP-A, une protéine membranaire du réticulum endoplasmique (RE) ancrée par sa queue (tail-anchored) qui organise des sites de contact membranaires entre le RE et de multiples organites. Via son domaine MSP, VAP-A interagit avec des protéines portant un motif FFAT afin de coordonner le transfert de lipides, le métabolisme des phosphoinositides, le trafic vésiculaire et l’homéostasie du RE, avec des effets en aval sur des processus tels que l’autophagie et la signalisation de stress. Les réseaux de contacts du RE dépendants de VAP-A influencent la distribution du cholestérol et des sphingolipides et soutiennent la fonction de la voie sécrétoire, reliant ainsi les perturbations de VAPA à des phénotypes cellulaires pertinents pour les études sur la neurodégénérescence, la dérégulation métabolique et la réplication des pathogènes. En tant qu’échafaudage aux jonctions interorganellaires, VAP-A est fréquemment utilisée pour étudier les mécanismes de dialogue entre organites, les flux lipidiques et la protéostasie en conditions physiologiques et de stress.

VAP-A Le plasmide double nickase (h) se compose d'une paire de plasmides appariés, conçus pour une édition hautement spécifique du locus VAPA dans les lignées cellulaires human. Chaque plasmide exprime une nickase Cas9 D10A et un sgRNA distinct ciblant des brins d'ADN opposés au sein de VAPA. Lorsqu'elles sont dirigées vers des sites adjacents sur des brins d'ADN opposés, les deux nickases génèrent des cassures simple brin décalées qui, ensemble, produisent une cassure double brin décalée, nécessitant une activité coordonnée sur la cible de la part des deux guides. La cassure d'ADN qui en résulte est résolue par les voies de réparation cellulaires endogènes, le plus souvent par jonction non homologue (NHEJ), ce qui conduit à des insertions ou des délétions qui perturbent la fonction de VAPA. En nécessitant l'engagement de deux ARNsg au locus cible, l'approche par double nick améliore la spécificité de l'édition et offre une stratégie CRISPR complémentaire pour les applications où un contrôle supplémentaire de la précision du ciblage est souhaité.

Afin de faciliter l'identification efficace des cellules éditées, un plasmide code pour la GFP permettant la visualisation par fluorescence des populations transfectées, tandis que le plasmide compagnon porte un gène de résistance à la puromycine pour la sélection antibiotique. Ensemble, ces caractéristiques favorisent l'enrichissement efficace des populations co-transfectées et simplifient la validation des clones présentant une perturbation de VAPA.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.