Plásmido CRISPR de Activación (h) V-ATPase B2: sc-401896-ACT

ATP6V1B2 codifica la subunidad B2 del dominio periférico V1 de la H+-ATPasa vacuolar (V-ATPasa), una bomba de protones multisubunidad que hidroliza ATP para acidificar endosomas, lisosomas y otros compartimentos intracelulares. Esta acidificación de los orgánulos es esencial para la endocitosis mediada por receptores, el flujo autofágico, la activación de enzimas lisosomales y el tráfico vesicular, y de forma indirecta moldea la detección de nutrientes y la adaptación metabólica vinculada a mTOR. Al regular el pH luminal, la actividad de la V-ATPasa influye en el procesamiento y recambio de proteínas, el procesamiento de antígenos y el reciclaje de proteínas de membrana. Las vías de acidificación vesicular y lisosomal desreguladas en las que participan componentes de la V-ATPasa se han asociado con fenotipos del neurodesarrollo y neurológicos, así como con trastornos más amplios del tráfico intracelular, lo que convierte a ATP6V1B2 en un nodo útil para estudiar la proteostasis y la disfunción endolisosomal.

V-ATPase B2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ATP6V1B2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

V-ATPase B2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ATP6V1B2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ATP6V1B2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de V-ATPase B2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ATP6V1B2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de V-ATPase B2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía V-ATPase B2 en células tumorales con expresión de ATP6V1B2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.