Plasmide CRISPR d'Activation (h) V-ATPase α1: sc-403882-ACT

ATP6V1A code la sous-unité α1 de la V-ATPase, un composant central du secteur cytosolique V1 qui couple l’hydrolyse de l’ATP à la translocation des protons par le complexe H⁺-ATPase vacuolaire. Cette enzyme acidifie les endosomes, les lysosomes et les vésicules sécrétoires, soutenant l’endocytose médiée par récepteur, le flux autophagique, le trafic membranaire et la maturation des protéines, tout en contribuant également, dans des contextes spécialisés, à l’homéostasie du pH à la membrane plasmique. En contrôlant l’acidification des organites, l’activité de la V-ATPase influence la détection des nutriments et des programmes de signalisation, notamment des voies liées à la régulation de mTORC1 et à la maturation des vésicules. Une acidification vacuolaire dérégulée et une fonction altérée d’ATP6V1A ont été associées à des phénotypes pertinents pour la neurobiologie, la biologie des cellules cancéreuses et les interactions hôte–pathogène, ce qui en fait une cible utile pour des études mécanistiques de la protéostasie et du transport intracellulaire.

V-ATPase α1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ATP6V1A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

V-ATPase α1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ATP6V1A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ATP6V1A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de V-ATPase α1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ATP6V1A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de V-ATPase α1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie V-ATPase α1 dans les cellules tumorales présentant une expression de ATP6V1A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.