UNC45A CRISPR Activation Plasmid (m): sc-430401-ACT

Unc45a kodiert UNC45A, ein konserviertes, myosingerichtetes Chaperon, das mit HSP90 zusammenwirkt, um die korrekte Faltung, Stabilität und funktionelle Assemblierung von Myosin-Motorproteinen zu fördern. Über die Regulation der Aktomyosin-Kontraktilität und der Zytoskelettorganisation trägt UNC45A zu Prozessen wie intrazellulärem Transport, Zellteilung und Zellmigration bei. In Mausmodellen kann eine Störung der UNC45A-Aktivität die Gewebemorphogenese und die zelluläre Mechanik beeinflussen, indem sie die Homöostase von Motorproteinen sowie Proteostase-Wege verändert. Eine fehlregulierte UNC45A-Expression oder -Funktion wurde in der Literatur mit Zytoskelettdefekten sowie aberranten proliferativen oder migratorischen Phänotypen in Verbindung gebracht, was ihre Relevanz für mechanistische Studien zu krankheitsassoziiertem Zellverhalten unterstreicht.

UNC45A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Unc45a-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

UNC45A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Unc45a-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Unc45a-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen UNC45A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Unc45a-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von UNC45A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des UNC45A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Unc45a-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.