UKHC CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402349-ACT

KIF5B kodiert die Kinesin‑1‑Schwerketten‑Isoform UKHC, einen mikrotubulibasierten Motor, der in polarisierten Zellen den ATP‑abhängigen anterograden Transport von Vesikeln, Proteinkomplexen und Organellen antreibt. Durch die koordinierte Zusammenarbeit mit Kinesin‑Leichtketten und Cargo‑Adaptoren unterstützt KIF5B den intrazellulären Transport, die Dynamik von Zentrosom und Spindel sowie die Organisation des Zytoskeletts und beeinflusst damit Prozesse wie Mitose, Sekretion und neuronalen Transport. Eine dysregulierte KIF5B‑Aktivität oder ‑Expression kann die Organellenverteilung und Signalübertragung stören; zudem wird KIF5B häufig im Zusammenhang mit onkogenen Genfusionen (z. B. KIF5B‑RET) und veränderten Proliferationswegen untersucht. Diese Eigenschaften machen KIF5B zu einem nützlichen Knotenpunkt, um Mikrotubuli‑Transportmechanismen, Zellzyklus‑Kontrolle und trafficking‑abhängige Signalwege in humanen Zellmodellen zu erforschen.

UKHC Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KIF5B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

UKHC Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KIF5B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KIF5B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen UKHC-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KIF5B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von UKHC-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des UKHC-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KIF5B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.