UGT8 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405110-ACT

UGT8 kodiert die UDP-Glykosyltransferase 8, ein Golgi-assoziiertes Enzym, das die Übertragung von Galaktose von UDP-Galaktose auf Ceramid katalysiert und dadurch Galaktosylceramid bildet, einen wichtigen Vorläufer für Sulfatid und andere Glykosphingolipide. Diese Aktivität unterstützt den Sphingolipidstoffwechsel und die Organisation von Membran-Mikrodomänen und beeinflusst dadurch vesikulären Transport, Zelladhäsion und Signaltransduktion in der Neuro- und Glia-Biologie. Veränderungen der Glykosphingolipid-Zusammensetzung, die mit einer Fehlregulation von UGT8 in Zusammenhang stehen, wurden in demyelinisierenden und neurodegenerativen Kontexten sowie bei Tumorzell-Phänotypen untersucht, bei denen eine Umgestaltung der Membranlipide Invasion und Stressantworten beeinflusst. Als Knotenpunkt in der Lipid-Glykosylierung wird UGT8 häufig hinsichtlich seines Einflusses auf myelinassoziierte Lipidprofile und glykosphingolipidabhängige Signalnetzwerke untersucht.

UGT8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen UGT8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

UGT8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des UGT8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der UGT8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen UGT8-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native UGT8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von UGT8-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des UGT8-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem UGT8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.