UGT1A4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402659-ACT

UGT1A4 kodiert eine UDP-Glucuronosyltransferase, die die Phase-II-Glucuronidierung verschiedener Xenobiotika und endogener Metaboliten katalysiert und dadurch deren Löslichkeit für die biliäre und renale Ausscheidung erhöht. Als mikrosomales Enzym, das überwiegend in der Leber exprimiert wird, trägt UGT1A4 zur zellulären Entgiftung und zur metabolischen Homöostase bei, indem es Substrate nachgeschalteter Glucuronid-Konjugationswege nach einer Oxidation durch Cytochrom P450 zuführt. Unterschiede in der Expression oder Aktivität von UGT1A4 wurden mit interindividuellen Unterschieden im Arzneistoffmetabolismus und in der Chemikaliensensitivität in Verbindung gebracht, was das Gen für die Pharmakogenomik und die toxikologische Forschung relevant macht. Die experimentelle Modulation von UGT1A4 liefert zudem Erkenntnisse für Studien zur hepatischen Differenzierung, zum endoplasmatisch-retikulum-gekoppelten Stoffwechsel und zu adaptiven Antworten auf chemischen Stress.

UGT1A4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen UGT1A4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

UGT1A4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des UGT1A4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der UGT1A4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen UGT1A4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native UGT1A4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von UGT1A4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des UGT1A4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem UGT1A4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.