UGCG Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403055-ACT

O UGCG humano codifica a UDP-glicose:ceramida glicosiltransferase, uma glicosiltransferase localizada no aparelho de Golgi que catalisa a primeira etapa comprometida na biossíntese de glicoesfingolipídios ao converter ceramida em glicosilceramida. Essa reação regula o balanço celular de ceramida e sustenta a produção subsequente de glicoesfingolipídios complexos que influenciam a organização de microdomínios de membrana, a sinalização de receptores, o tráfego vesicular e as interações célula–célula. A atividade de UGCG intersecciona o metabolismo de esfingolipídios e vias de resposta ao estresse, moldando processos como diferenciação, susceptibilidade à apoptose e sinalização inflamatória. A desregulação da homeostase de glicoesfingolipídios envolvendo UGCG tem sido associada a fenótipos neurodegenerativos e metabólicos e tem sido estudada em contextos oncológicos, nos quais alterações na sinalização lipídica podem modular a proliferação e a resposta a fármacos.

UGCG O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de UGCG sem alterar a sequência de ADN subjacente.

UGCG O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus UGCG em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição UGCG, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de UGCG. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus UGCG nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de UGCG no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via UGCG em células tumorais com expressão de UGCG silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.