Ubr1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403943-ACT

Humanes UBR1 kodiert die E3-Ubiquitin-Ligase Ubr1, eine zentrale Erkennungskomponente des N-end-rule-Signalwegs, der N-terminale Degrons mit dem ubiquitinabhängigen proteasomalen Abbau verknüpft. Durch die Kontrolle der Stabilität fehlgefalteter, geschädigter oder regulatorischer Proteine trägt Ubr1 zur zytosolischen Proteinkontrolle, zur Stressadaptation und zu umfassenderen Proteostase-Netzwerken bei, die mit dem Ubiquitin-Proteasom-System verknüpft sind. Die UBR1-Aktivität beeinflusst die zelluläre Homöostase durch regulierten Substratabbau und wirkt sich auf Signaldynamik und metabolische Antworten aus. Genetische Störungen von UBR1 sind mit vererbten Krankheitsphänotypen assoziiert, was seine Relevanz für die Untersuchung von Mechanismen des Proteostaseversagens und von Genotyp-Phänotyp-Beziehungen in menschlichen Zellen unterstreicht.

Ubr1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen UBR1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Ubr1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des UBR1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der UBR1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Ubr1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native UBR1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Ubr1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Ubr1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem UBR1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.