Plasmide CRISPR d'Activation (h) UBE2S: sc-404140-ACT

UBE2S (enzyme de conjugaison de l’ubiquitine E2 S) est une enzyme E2 de conjugaison de l’ubiquitine qui allonge les chaînes de polyubiquitine liées en K11. Elle agit en association avec le complexe promoteur de l’anaphase/cyclosome (APC/C) afin de favoriser l’ubiquitination et la dégradation, en temps opportun, des régulateurs du cycle cellulaire. Par cette activité, UBE2S contribue à coordonner la progression de la mitose, la levée du point de contrôle du fuseau et une sortie ordonnée de mitose, soutenant ainsi la stabilité du génome et une prolifération contrôlée. Une expression ou une activité dérégulée d’UBE2S a été associée à des anomalies de la protéostase et du contrôle du cycle cellulaire dans de multiples contextes pathologiques, notamment dans des cancers où le remodelage des voies de l’ubiquitine est fréquent. En tant que nœud de la signalisation dépendante de l’ubiquitine, UBE2S est également utilisée pour étudier les interactions (crosstalk) entre la fonction de l’APC/C, le renouvellement médié par le protéasome et les voies sensibles au stress qui influencent les décisions de destinée cellulaire.

UBE2S Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de UBE2S sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

UBE2S Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus UBE2S dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription UBE2S, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de UBE2S. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus UBE2S natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de UBE2S au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie UBE2S dans les cellules tumorales présentant une expression de UBE2S silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.