Plasmide CRISPR d'Activation (h) Tyrosine Hydroxylase: sc-400273-ACT

TH code la tyrosine hydroxylase, l’enzyme limitante de la biosynthèse des catécholamines qui convertit la L-tyrosine en L-DOPA, contrôlant ainsi la production en aval de dopamine, de noradrénaline et d’adrénaline. Son activité s’intègre au métabolisme du cofacteur tétrahydrobioptérine (BH4) et est régulée par des voies de signalisation dépendantes de la phosphorylation, qui ajustent la production de neurotransmetteurs en réponse à l’activité neuronale et aux signaux de stress. L’expression de TH et le contrôle de son activité enzymatique sont au cœur de l’identité des neurones dopaminergiques et noradrénergiques, de la transmission synaptique et de la fonction neuroendocrinienne. Une dérégulation de TH et de l’homéostasie des catécholamines est impliquée dans la biologie de maladies neurologiques et neuropsychiatriques, notamment des troubles affectant les circuits dopaminergiques et la régulation autonome.

Tyrosine Hydroxylase Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TH sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Tyrosine Hydroxylase Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TH dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TH, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Tyrosine Hydroxylase. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TH natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Tyrosine Hydroxylase au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Tyrosine Hydroxylase dans les cellules tumorales présentant une expression de TH silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.