Tyrosine Hydroxylase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400273-ACT

TH kodiert die Tyrosinhydroxylase, das geschwindigkeitsbestimmende Enzym der Catecholamin-Biosynthese, das L‑Tyrosin zu L‑DOPA umwandelt und dadurch die nachgeschaltete Produktion von Dopamin, Noradrenalin und Adrenalin steuert. Seine Aktivität ist in den Stoffwechsel des Kofaktors Tetrahydrobiopterin (BH4) eingebunden und wird durch phosphorylierungsabhängige Signalwege reguliert, die die Neurotransmitterausgabe als Antwort auf neuronale Aktivität und Stresssignale feinabstimmen. TH-Expression und enzymatische Kontrolle sind zentral für die Identität dopaminerger und noradrenerger Neuronen, die synaptische Transmission und die neuroendokrine Funktion. Eine Fehlregulation von TH und der Catecholamin-Homöostase wird mit der Biologie neurologischer und neuropsychiatrischer Erkrankungen in Verbindung gebracht, einschließlich Störungen, die dopaminerge Schaltkreise und die autonome Regulation betreffen.

Tyrosine Hydroxylase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TH-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Tyrosine Hydroxylase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TH-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TH-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Tyrosine Hydroxylase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TH-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Tyrosine Hydroxylase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Tyrosine Hydroxylase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TH-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.