tsg 101 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400290-ACT

TSG101 (Tumor-Suszeptibilitätsgen 101) kodiert das Protein tsg101, eine zentrale Komponente des ESCRT-I-Komplexes, der die endosomale Sortierung, die Erkennung ubiquitinierter Fracht und die Biogenese multivesikulärer Körper koordiniert. Über ESCRT-abhängige Membranumbauvorgänge trägt TSG101 zur Herunterregulation von Rezeptoren, zur Zytokinese (Abscission), zu autophagiegekoppeltem Transport und zur Exosomenbildung bei und spielt zudem eine Rolle bei der Knospung behüllter Viren. Störungen des von TSG101 regulierten Transports können die Signaldynamik von Oberflächenrezeptoren und Stressantworten verändern und verknüpfen diesen Signalweg mit onkogenen Prozessen, mit neurodegenerationsassoziierten Defekten der Proteostase sowie mit Studien zur viralen Replikation. Als breit exprimierter Adapter im Membrantransport wird TSG101 häufig als mechanistischer Einstiegspunkt genutzt, um intrazellulären Transport und vesikelvermittelte Kommunikation in menschlichen Zellen zu untersuchen.

tsg 101 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TSG101-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

tsg 101 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TSG101-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TSG101-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen tsg 101-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TSG101-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von tsg 101-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des tsg 101-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TSG101-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.