TRRAP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402748-ACT

TRRAP (transformation/transcription domain-associated protein) ist ein großes Adapterprotein, das als essenzieller Kofaktor für mehrere Histon-Acetyltransferase-Komplexe fungiert, darunter SAGA und TIP60, und sequenzspezifische Transkriptionsfaktoren mit dem Chromatin-Remodeling verknüpft. Durch die Koordination einer acetylierungsabhängigen Regulation der Genexpression beeinflusst TRRAP die Zellzyklusprogression, DNA-Schadensantworten und Differenzierungsprogramme. Es ist an Signalwegen beteiligt, die durch die Transkriptionsnetzwerke von MYC und E2F gesteuert werden, und unterstützt die Genomintegrität durch eine chromatinvermittelte Kontrolle von Reparaturprozessen und replikationsassoziiertem Stress. Eine fehlregulierte TRRAP-Aktivität und eine veränderte Assemblierung der Komplexe wurden mit onkogenen Transkriptionszuständen und neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen in Verbindung gebracht, was TRRAP zu einem relevanten Ziel für mechanistische Studien der epigenetischen Regulation macht.

TRRAP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TRRAP-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TRRAP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TRRAP-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TRRAP-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TRRAP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TRRAP-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TRRAP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TRRAP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TRRAP-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.