TREK-1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-421244-ACT

Mouse Kcnk2 codifica TREK-1, un canale del potassio (K2P) a due pori sensibile alle sollecitazioni meccaniche, che fornisce una conduttanza basale di K+ per stabilizzare il potenziale di membrana a riposo e modulare l’eccitabilità di neuroni e cellule gliali. TREK-1 integra segnali provenienti dallo stiramento della membrana, dalla temperatura, dal pH intracellulare e da mediatori lipidici, collegando stimoli biofisici a cambiamenti della polarizzazione di membrana e plasmando la generazione dei potenziali d’azione e la trasmissione sinaptica. Grazie al suo ruolo nel mantenimento dell’omeostasi ionica, TREK-1 influenza processi quali la neuroprotezione, l’elaborazione dei segnali dolorifici e l’attività dei circuiti responsivi allo stress. Alterazioni della funzione di Kcnk2/TREK-1 sono state studiate in relazione a fenotipi neurologici e neuropsichiatrici, rendendolo un target rilevante per l’analisi meccanicistica di vie di segnalazione in sistemi di modelli murini.

TREK-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Kcnk2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TREK-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Kcnk2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Kcnk2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TREK-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Kcnk2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TREK-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TREK-1 nelle cellule tumorali con espressione di Kcnk2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.