TREK-1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-421244-ACT

Das Mausgen **Kcnk2** kodiert **TREK-1**, einen mechanosensitiven Kaliumkanal der Zwei-Poren-Domäne (K2P), der eine Hintergrund-K+-Leitfähigkeit bereitstellt, um das Ruhemembranpotenzial zu stabilisieren und die Erregbarkeit von Neuronen und Gliazellen fein abzustimmen. TREK-1 integriert Signale aus Membrandehnung, Temperatur, intrazellulärem pH-Wert und Lipidmediatoren, um biophysikalische Reize in Änderungen der Membranpolarisation zu übersetzen und dadurch Aktionspotenzial-Feuerung und synaptische Transmission zu formen. Über seine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Ionenhomöostase beeinflusst TREK-1 Prozesse wie Neuroprotektion, die Verarbeitung von Schmerzsignalen und die Aktivität stressresponsiver Schaltkreise. Eine veränderte Kcnk2-/TREK-1-Funktion wurde im Zusammenhang mit neurologischen und neuropsychiatrischen Phänotypen untersucht, was sie für die mechanistische Analyse von Signalwegen in Mausmodellsystemen relevant macht.

TREK-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Kcnk2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TREK-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Kcnk2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Kcnk2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TREK-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Kcnk2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TREK-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TREK-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Kcnk2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.