Treacle CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403067-ACT

Das humane Gen **TCOF1** kodiert Treacle, ein nukleoläres Phosphoprotein, das für die Ribosomenbiogenese und die Entwicklung der Neuralleiste essenziell ist. Treacle ist an der Transkription der rDNA und der Prozessierung der prä-rRNA beteiligt und koordiniert über Interaktionen mit RNA-Polymerase‑I-assoziierten Faktoren nukleoläre Stressantworten. Eine Störung von **TCOF1** beeinträchtigt die nukleoläre Homöostase, beeinflusst p53-gekoppelte Stress-Signalwege und verändert Programme der Proliferation und Differenzierung. Pathogene Varianten in **TCOF1** sind mit dem Treacher-Collins-Syndrom assoziiert, weshalb die Regulation von **TCOF1** für Studien zur kraniofazialen Entwicklung und zu Ribosomopathien relevant ist.

Treacle Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TCOF1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Treacle Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TCOF1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TCOF1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Treacle-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TCOF1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Treacle-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Treacle-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TCOF1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.