TRC8 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-429220-ACT

Rnf139 kodiert TRC8, eine im endoplasmatischen Retikulum (ER) lokalisierte RING-Finger-E3-Ubiquitin-Ligase, die an ubiquitinabhängigem Proteinumsatz und ER-assoziiertem Abbau (ERAD) beteiligt ist. Durch die Kopplung der Ubiquitinierung an den proteasomalen Abbau trägt TRC8 zur Proteostase bei und kann über Interaktionen mit membranständigen Signal- und Stoffwechselregulatoren auch lipid- und sterolregulierte Prozesse beeinflussen. Eine veränderte TRC8-Aktivität wurde mit fehlregulierter Wachstumskontrolle und zellulären Stressantworten in Verbindung gebracht, wodurch Rnf139 einen geeigneten Knotenpunkt für die Untersuchung der Ubiquitin-Signalgebung in Signalwegen darstellt, die für Genomstabilität, metabolische Homöostase und onkogene Transformation relevant sind. In Mausmodellen ermöglicht die Modulation der Rnf139-Expression mechanistische Studien zur gewebespezifischen Proteostase und zur Umprogrammierung von Signalwegen.

TRC8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Rnf139-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TRC8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Rnf139-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Rnf139-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TRC8-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Rnf139-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TRC8-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TRC8-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Rnf139-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.