TRAP230 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404820-ACT

MED12 kodiert TRAP230, eine zentrale Untereinheit des Mediator-Transkriptionskoaktivator-Komplexes, der sequenzspezifische Transkriptionsfaktoren mit der RNA-Polymerase II verbindet, um Genexpressionsprogramme zu koordinieren. TRAP230 ist an signalabhängiger Transkription beteiligt, einschließlich Signalwegen nachgeschaltet von Wnt/β-Catenin, nukleären Rezeptoren und anderen Entwicklungsregulatoren, und beeinflusst dadurch Zellschicksalsentscheidungen, Proliferation und Differenzierung. Eine veränderte MED12-Funktion oder -Expression wird mit neuroentwicklungsbezogenen Syndromen sowie mit verschiedenen Tumorkontexten in Verbindung gebracht, vermittelt durch eine fehlregulierte Transkriptionskontrolle und Enhancer-Aktivität. Daher wird MED12/TRAP230 häufig im Zusammenhang mit chromatinregulierter Genexpression, Linienspezifizierung und dem Umverdrahten transkriptioneller Netzwerke untersucht.

TRAP230 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MED12-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TRAP230 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MED12-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MED12-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TRAP230-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MED12-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TRAP230-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TRAP230-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MED12-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.