Particules Lentivirales d'Activation (h) TPCN2: sc-402960-LAC

TPCN2 (canal à deux pores 2) code un canal cationique endolysosomal qui régule les flux ioniques intracellulaires, avec des rôles marqués dans la signalisation du Ca²⁺ dépendante du NAADP à partir d’organites acides. En modulant la dynamique endosome–lysosome, le trafic vésiculaire et l’excitabilité des organites, TPCN2 influence des processus en aval, notamment l’autophagie, les événements de fusion membranaire et les cascades de signalisation dépendantes du Ca²⁺. Des variations de l’activité de TPCN2 ont été associées à des modifications de la biologie de la pigmentation ainsi qu’à des phénotypes métaboliques, et une signalisation endolysosomale dérégulée impliquant TPCN2 est pertinente pour l’étude de la neurodégénérescence et du comportement des cellules cancéreuses. Ces caractéristiques font de TPCN2 une cible utile pour disséquer les réseaux de signalisation lysosomale et les réponses cellulaires régulées par le Ca²⁺ dans des systèmes modèles humains.

Les particules d'activation lentivirales TPCN2 (h) répondent à ce besoin en encapsulant le système complet d'activation transcriptionnelle SAM (Synergistic Activation Mediator) dans des particules lentivirales à titre élevé prêtes à la transduction, permettant une régulation à la hausse efficace de TPCN2 dans un plus large éventail de types de cellules humaines.

Les particules d'activation lentivirales TPCN2 (h) délivrent tous les composants fonctionnels du système médiateur d'activation synergique (SAM) via la transduction lentivirale. Le système comprend trois préparations de particules co-transduites dans les cellules cibles : l'une codant pour une dCas9 catalytiquement inactive (mutations D10A et N863A) fusionnée au domaine de transactivation VP64 avec un gène de résistance à la blasticidine ; une codant pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1 avec un gène de résistance à l'hygromycine ; et une codant pour un ARNsg de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 avec un gène de résistance à la puromycine. Après transduction lentivirale et intégration génomique des cassettes d'expression, les composants du SAM sont exprimés de manière stable et s'assemblent au locus cible dans la région promotrice proximale en amont du site de départ de la transcription TPCN2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de manière coopérative pour recruter l'appareil transcriptionnel endogène et induire une régulation à la hausse soutenue de l'expression endogène de TPCN2. L'utilisation de dCas9 inactif sur les nucléases évite l'introduction de cassures double brin de l'ADN et préserve le locus génomique natif TPCN2 ainsi que l'architecture régulatrice.

Le format lentiviral offre plusieurs avantages pratiques : l'intégration génomique stable permet une activation héréditaire au fil des divisions cellulaires ; les préparations de particules à titre élevé éliminent le besoin d'une production virale en interne ; et la compatibilité avec les types de cellules primaires, non divisibles et résistantes à la transfection élargit l'accessibilité expérimentale. Le succès de la transduction peut être confirmé et renforcé par une triple sélection antibiotique utilisant la puromycine, l'hygromycine et la blasticidine.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.