Plasmide CRISPR d'Activation (h) Topo IIα: sc-400869-ACT

TOP2A code la topoisomérase IIα humaine, une enzyme ATP-dépendante qui résout la surenroulement de l’ADN et les caténanes d’ADN en générant des cassures transitoires double brin, permettant une condensation et une ségrégation fidèles des chromosomes. La topo IIα est un composant central des réponses au stress de la réplication de l’ADN et de la transcription, et elle est nécessaire à la décaténation en fin de phase S ainsi qu’à la progression G2/M. Son activité est étroitement liée à la régulation du cycle cellulaire, à la signalisation des dommages à l’ADN et au maintien de la stabilité du génome. Une expression dérégulée de TOP2A est fréquemment associée à des états hautement prolifératifs et est étudiée dans le contexte de l’instabilité chromosomique et de la biologie des cancers.

Topo IIα Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TOP2A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Topo IIα Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TOP2A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TOP2A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Topo IIα. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TOP2A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Topo IIα au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Topo IIα dans les cellules tumorales présentant une expression de TOP2A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.