Tom20 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400041-ACT

O TOMM20 humano codifica a Tom20, um receptor central do complexo translocase da membrana externa mitocondrial (TOM) que reconhece pré-sequências de direcionamento N-terminais e inicia a importação de proteínas codificadas no núcleo para as mitocôndrias. Ao controlar o tráfego de proteínas mitocondriais, a Tom20 sustenta a fosforilação oxidativa, a dinâmica mitocondrial e a proteostase, além de influenciar as respostas celulares ao estresse energético. Alterações na expressão ou na função de TOMM20 têm sido associadas à disfunção mitocondrial e a perturbações na apoptose e na sinalização imune inata, tornando-o relevante para estudos do metabolismo do câncer e de mecanismos de doenças neurodegenerativas. Assim, TOMM20 é amplamente utilizado como marcador mitocondrial e como um nó funcional que conecta a biogênese de organelas a vias de sobrevivência celular.

Tom20 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TOMM20 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Tom20 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TOMM20 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TOMM20, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Tom20. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TOMM20 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Tom20 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Tom20 em células tumorais com expressão de TOMM20 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.