TNF-R1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400206-ACT

TNFRSF1A kodiert TNF‑R1, einen ubiquitär exprimierten TNF‑Rezeptor, der als Reaktion auf TNF Signalwege initiiert und so Entzündungen, Zellüberleben und Zelltod reguliert. Die Ligandenbindung fördert die Assemblierung rezeptorassoziierter Komplexe, die NF‑κB‑ und MAPK‑Signalwege für transkriptionelle Antworten modulieren, und kann – abhängig vom zellulären Kontext – die Signalübertragung auch in Richtung Caspase‑Aktivierung und regulierter Nekrose lenken. Über diese Mechanismen prägt TNF‑R1 Zytokinnetzwerke, die Rekrutierung von Leukozyten und die Gewebehomöostase. Eine fehlregulierte TNFRSF1A/TNF‑R1‑Signalgebung wurde mit autoinflammatorischen Phänotypen und allgemeineren Mechanismen entzündlicher Erkrankungen in Verbindung gebracht, was ihren Einsatz in mechanistischen Studien zur Immun-Signalübertragung und zu Stressantworten unterstützt.

TNF-R1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TNFRSF1A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TNF-R1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TNFRSF1A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TNFRSF1A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TNF-R1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TNFRSF1A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TNF-R1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TNF-R1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TNFRSF1A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.