TMEM38B CRISPR Activation Plasmid (h): sc-412461-ACT

TMEM38B kodiert den trimeren intrazellulären Kationenkanal A (TRIC-A), ein Membranprotein des endoplasmatischen/sarkoplasmatischen Retikulums (ER/SR), das monovalente Kationenkanäle bildet und die Ca2+-Freisetzung durch Bereitstellung eines Gegenionenstroms unterstützt. Durch die Stabilisierung des ER/SR-Membranpotenzials während einer IP3-Rezeptor- und Ryanodinrezeptor-abhängigen Kalziumsignalgebung trägt TMEM38B zur Erregungs‑Kontraktions‑Kopplung, zur intrazellulären Kalziumhomöostase und zu nachgeschalteten, kalziumregulierten Transkriptionsprogrammen bei. Eine Beeinträchtigung der TMEM38B-Funktion wurde mit der Skelettentwicklung und der Integrität des Bindegewebes in Verbindung gebracht; Loss-of-Function-Varianten sind mit osteogenesis-imperfecta-ähnlichen Phänotypen assoziiert. Diese Eigenschaften machen TMEM38B relevant für mechanistische Studien zur ER-Kalziumhandhabung, zur Matrixbiologie und zu stressassoziierten Signalantworten in menschlichen Zellen.

TMEM38B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TMEM38B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TMEM38B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TMEM38B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TMEM38B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TMEM38B-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TMEM38B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TMEM38B-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TMEM38B-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TMEM38B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.