TLR4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400068-ACT

Humanes TLR4 (Toll-like-Rezeptor 4) ist ein Mustererkennungsrezeptor, der Lipopolysaccharid sowie weitere pathogen- und schädigungsassoziierte molekulare Muster an der Plasmamembran erkennt. Nach Ligandenbindung zusammen mit Korezeptoren wie MD-2 und CD14 initiiert TLR4 MyD88- und TRIF-abhängige Signalkaskaden, die NF-κB, AP-1 und IRF3 aktivieren und dadurch Transkriptionsprogramme für entzündliche Zytokine und Typ-I-Interferonantworten antreiben. Diese Signalwege koordinieren die Aktivierung der angeborenen Immunität, die Rekrutierung von Leukozyten und die Kommunikation mit der adaptiven Immunität über antigenpräsentierende Zellen. Eine fehlregulierte TLR4-Signalübertragung wird mit chronischen Entzündungszuständen und immunvermittelter Pathologie in Verbindung gebracht und wird breit untersucht, unter anderem im Kontext der Sepsisbiologie, Atherosklerose, metabolischer Inflammation und tumorassoziierter Entzündung.

TLR4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TLR4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TLR4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TLR4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TLR4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TLR4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TLR4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TLR4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TLR4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TLR4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.