TLE1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400343-ACT

TLE1 (transducin-like enhancer of split 1) ist ein transkriptioneller Korepressor der Groucho/TLE-Familie, der die Genexpression moduliert, indem er mit DNA-bindenden Transkriptionsfaktoren interagiert und chromatinmodifizierende Komplexe rekrutiert. Er ist vor allem dafür bekannt, Entwicklungs- und Linienfestlegungsprogramme zu prägen, indem er Wnt/β-Catenin-Zielgene reprimiert und mit Notch-, TGF-β- und anderen differenzierungsassoziierten Signalwegen interagiert. Durch die Beeinflussung des Chromatinzustands und der transkriptionellen Ausgabe trägt TLE1 zur Kontrolle von Proliferation, Zellschicksalsentscheidungen und Gewebehomöostase bei. Eine fehlregulierte TLE1-Expression oder ein veränderter Signal-Kontext wird mit onkogenen Transkriptionsprogrammen in Verbindung gebracht, und TLE1 wird in der Krebsbiologie breit als molekularer Marker und regulatorischer Knotenpunkt untersucht.

TLE1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TLE1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TLE1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TLE1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TLE1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TLE1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TLE1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TLE1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TLE1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TLE1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.