TIM-3 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-431363-ACT

Das Mausgen **Havcr2** kodiert das T‑Zell‑Immunglobulin- und Muzin-Domäne-enthaltende Protein 3 (TIM‑3), einen Immun-Checkpoint-Rezeptor, der auf aktivierten T‑Zellen, regulatorischen T‑Zellen sowie auf angeborenen Immunzell-Subsets einschließlich dendritischer Zellen und Makrophagen exprimiert wird. TIM‑3 integriert Signale von Liganden wie Galectin‑9 und Phosphatidylserin, um die durch den T‑Zell‑Rezeptor vermittelte Aktivierung, die Zytokinproduktion und Programme der Immuntoleranz zu modulieren. Durch Wechselwirkungen mit inhibitorischen Signalwegen und Netzwerken der Antigenpräsentation trägt TIM‑3 zur Regulation der Effektor-Differenzierung und zu Merkmalen bei, die bei anhaltender Antigenexposition mit einer T‑Zell‑Dysfunktion assoziiert sind. Eine fehlregulierte Havcr2/TIM‑3‑Signalgebung wurde in präklinischen Modellen mit entzündlichen und autoimmunen Phänotypen in Verbindung gebracht und wird breit im Kontext tumorassoziierter Immunsuppression sowie der Biologie chronischer Infektionen untersucht.

TIM-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Havcr2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TIM-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Havcr2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Havcr2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TIM-3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Havcr2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TIM-3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TIM-3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Havcr2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.