TIF1β CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401999-ACT

TRIM28, auch bekannt als TIF1β (KAP1), ist ein KRAB-assoziierter transkriptioneller Korepressor, der epigenetische Genstilllegung koordiniert, indem er Chromatin-Modifikatoren wie SETDB1 und den NuRD/HDAC-Komplex rekrutiert, um mit H3K9me3 markiertes Heterochromatin zu etablieren. Es spielt eine zentrale Rolle bei der Regulation transponierbarer Elemente, der genomischen Stabilität, der DNA-Schadensantwort und der Aufrechterhaltung der Zellidentität durch eine umfassende Kontrolle von Transkriptionsprogrammen. Die TRIM28-abhängige Repression ist mit Signalwegen verknüpft, die die Chromatinorganisation, ubiquitinvermittelte Signalübertragung und entwicklungsbezogene Transkriptionsnetzwerke steuern. Eine Fehlregulation der TRIM28/TIF1β-Aktivität wurde mit veränderten Differenzierungszuständen und aberranter transkriptioneller Repression in verschiedenen krankheitsrelevanten Kontexten in Verbindung gebracht, darunter onkogenes epigenetisches Remodeling und neuroentwicklungsbezogene Phänotypen.

TIF1β Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TRIM28-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TIF1β Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TRIM28-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TRIM28-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TIF1β-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TRIM28-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TIF1β-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TIF1β-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TRIM28-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.