Thyroglobulin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401985-ACT

TG codifica la tireoglobulina, una grande glicoproteina secreta prodotta dalle cellule follicolari tiroidee che funge da principale impalcatura per la biosintesi degli ormoni tiroidei. Nel lume follicolare, la iodurazione e l’accoppiamento dei residui tirosilici sulla tireoglobulina consentono la produzione di T3 e T4 e si integrano con il trasporto dello iodio, l’attività della tireoperossidasi e i programmi di differenziamento tiroideo guidati dal TSH. L’espressione e la maturazione della TG sono legate al ripiegamento delle proteine nel reticolo endoplasmatico e ai meccanismi di controllo qualità, nonché al traffico vescicolare che regolano la secrezione della tireoglobulina e l’omeostasi del colloide. La deregolazione di TG è associata a difetti ereditari della sintesi degli ormoni tiroidei ed è rilevante per studi sulla disfunzione tiroidea, sulla biologia degli autoantigeni e sull’identità delle cellule follicolari.

Thyroglobulin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TG senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Thyroglobulin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TG nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TG, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Thyroglobulin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TG nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Thyroglobulin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Thyroglobulin nelle cellule tumorali con espressione di TG silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.