Plasmide CRISPR d'Activation (h) TFPI: sc-416811-ACT

Le TFPI (tissue factor pathway inhibitor) humain est un inhibiteur de protéases à sérine de type Kunitz, sécrété, qui limite l’initiation de la coagulation sanguine en inhibant le complexe facteur tissulaire–facteur VIIa et le facteur Xa, réduisant ainsi la génération de thrombine en aval. L’activité du TFPI s’inscrit à l’interface de la biologie endothéliale, de l’homéostasie vasculaire et de la signalisation inflammatoire, et sa régulation influence l’équilibre entre les voies procoagulantes et anticoagulantes. Des altérations de l’expression ou de la fonction du TFPI ont été associées à des phénotypes de risque thrombotique et à la physiopathologie vasculaire, ce qui en fait une cible utile pour étudier les mécanismes liés à la coagulation dans les cellules endothéliales et dans des systèmes modèles pertinents pour le plasma.

TFPI Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TFPI sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TFPI Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TFPI dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TFPI, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TFPI. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TFPI natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TFPI au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TFPI dans les cellules tumorales présentant une expression de TFPI silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.