TFEB CRISPR Activation Plasmid (m): sc-437332-ACT

Mouse Tfeb kodiert den Transkriptionsfaktor EB (TFEB), einen basischen Helix-Loop-Helix-Leucin-Zipper‑Regulator, der über das CLEAR-Gen-Netzwerk die Lysosomenbiogenese und Autophagie koordiniert. TFEB integriert Nährstoff- und Stresssignale nachgeschaltet von mTORC1 und verwandten Kinase-Signalwegen, um die Lysosomenfunktion, den endolysosomalen Transport und die zelluläre Proteostase zu steuern. Eine veränderte TFEB-Aktivität wurde mit fehlregulierten Autophagie‑Lysosomen‑Signalwegen in Verbindung gebracht, die an Neurodegeneration, Stoffwechselstörungen und lysosomalen Speicherkrankheits‑ähnlichen Phänotypen beteiligt sind, was TFEB zu einem zentralen Knotenpunkt für mechanistische Studien zellulärer Clearance-Programme macht.

TFEB Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Tfeb-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TFEB Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Tfeb-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Tfeb-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TFEB-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Tfeb-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TFEB-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TFEB-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Tfeb-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.