Telethonin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402317-ACT

TCAP kodiert Telethonin, ein sarkomerisches Z‑Scheiben-Protein, das an das N‑Terminus von Titin (TTN) bindet und zur Stabilisierung der Myofibrillenassemblierung sowie der mechanischen Kopplung in quergestreifter Muskulatur beiträgt. Telethonin ist an der Integrität des Sarkomers und an mechanotransduktionsassoziierten Signalwegen beteiligt und koordiniert während der Muskelentwicklung und -anpassung die Organisation von Proteinkomplexen an der Z‑Scheibe. Störungen der TCAP-Expression oder der Telethonin-Funktion wurden mit erblichen Kardiomyopathien und Erkrankungen der Skelettmuskulatur in Verbindung gebracht, was die Empfindlichkeit der kontraktilen Architektur gegenüber der Stöchiometrie von Z‑Scheiben-Proteinen widerspiegelt. Als Knotenpunkt in titinzentrierten Assemblies wird Telethonin häufig in Signalwegen untersucht, die die Zytoskelettorganisation, den Erhalt von Muskelfasern und stressinduzierte Umbauprozesse regulieren.

Telethonin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TCAP-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Telethonin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TCAP-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TCAP-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Telethonin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TCAP-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Telethonin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Telethonin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TCAP-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.